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CART抗肿瘤研究的最新进展及展望
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嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（CAR-T）
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（CAR-T）是一种过继性细胞免疫治疗（ACI）,并在近年来得到迅猛发展.通过导入外源基因使T细胞表达嵌合抗原受体（CAR）,在肿瘤免疫效应上表现高特异性、靶向性、MHC非限制性等特点。在近期的临床结果显示，CAR-T细胞疗法能完全消除血液瘤肿瘤，达到治愈的效果；同时在实体瘤的临床试验中也取得了一定疗效。但在获得显著疗效的同时，CAR-T也存在脱靶效应、细胞因子风暴、插入突变、对实体肿瘤疗效有限等问题。现就CAR-T技术的最新进展及该领域有待解决的问题进行探讨，为CAＲ-T疗法的进一步研究和临床应用提供参考。
CAR-T简介
CAR-T，全称是ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。通过基因工程的方法，将能够识别和结合特异性肿瘤抗原的单链抗体与T细胞内的信号分子进行融合，通过病毒载体或转座子系统等转染T细胞，使T细胞表面表达嵌合抗原受体，从而特异性识别和结合肿瘤细胞表面的抗原并裂解肿瘤细胞。在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。
CAR-T的原理
1、肿瘤免疫逃避
恶性肿瘤的治疗困难与肿瘤免疫逃避有很大的关系。
其机制如下：
缺乏抗原性表位
MHC-I类抗原表达减少
肿瘤抗原诱导的免疫耐受
肿瘤抗原被覆盖
肿瘤产生免疫抑制物
2、CART免疫治疗
增强免疫系统对肿瘤的杀伤能力
CART免疫疗法摆脱了传统治疗手段对于MHC的限制，基因修饰的T细胞不依赖于MHC的识别，而是通过人工合成的单链抗体精确的识别靶细胞，通过预先调节表达在T细胞表面的单恋抗体，基因修饰的T细胞能靶向不同的肿瘤抗原，当基因修饰的T细胞精确识别靶细胞后，通过跨膜信号域，将信号传递给包内刺激信号域，刺激T细胞活化，增值，分泌细胞因子裂解靶细胞。同时基因修饰的T细胞还可产生抑制肿瘤微环境的因子如，IL-2等。或与PD-1抗体联用阻断肿瘤释放的免疫抑制信号。
肿瘤治疗手段的比较
CAR-T·治疗过程
CAR-T·治疗优势
CAR-T抗肿瘤效应及临床转化
1，［1］抗血液肿瘤效果CAR-T技术在血液系统恶性肿瘤治疗中取得了令人瞩目的成绩。靶向CD19的CAR-T细胞在临床上研究最多，在CAR-T靶点开发领域具有里程碑式的意义。年，美国国家癌症研究所的研究表明，CD19特异性的CAＲ-T用于治疗晚期B淋巴瘤疗效明显［2］。随后，靶向CD19的CAＲ-T被用于治疗淋巴细胞白血病，Maude等［3］的研究表明，CTL(抗CD19的二代CAＲ-T)治疗30例复发/难治急性淋巴细胞白血病，其中90%达完全缓解。对于复发耐药的慢性淋巴细胞白血病，靶向CD19的CAR-T能稳定持久地清除体内肿瘤，总反应率达57%［4］。Garfall等［5］报道了一例CD19特异性CAR-T联合自体移植治愈多发性骨髓瘤的病例，显示了其在多发性骨髓瘤中的治疗潜力。两家研究单位分别报道了靶向抗原LewisY和CD33的CAR-T在急性髓细胞白血病中的临床小样本研究，前者4例患者入组，1例达细胞学缓解，3例部分缓解/疾病稳定，后者1例患者入组并获得细胞学缓解［6-7］。医院的Dai等［8］、医院的克晓燕［9］分别总结了CAR-T细胞在治疗血液肿瘤中已发表的20篇临床试验结果及应用进展，可以看出CAＲ-T在治疗血液恶性肿瘤中疗效可观。
2，抗实体瘤效果CAＲ-T在血液肿瘤治疗中获得了突破，但由于受实体瘤中微环境复杂，免疫逃逸机制多样，肿瘤抗原靶点繁杂，且实体瘤体积大、CAR-T细胞难以归巢到肿瘤组织等多方面因素的影响［10］，CAR-T在实体瘤的治疗实践中仍有部分障碍。一代CAR-T对实体肿瘤的治疗大多无效，但据此探索了CAＲ-T治疗的可行性和安全性标准。二至四代CAＲ-T在增殖、细胞因子释放等方面有了明显改进，在部分临床试验中也崭露头角，越来越多的临床试验正尝试将CAR-T用于各种实体瘤的治疗
2．1妇科肿瘤卵巢癌是预后最差的妇科恶性肿瘤，近半个世纪以来其临床诊治无突破性进展，是最早尝试CAＲ-T治疗的实体瘤之一。叶酸受体α(FＲα)是卵巢癌相关肿瘤抗原。年，研究者应用针对FＲα的一代CAＲ-T细胞治疗14例FＲ+的复发性卵巢癌患者，所有患者均能耐受该治疗，但是没有患者从治疗中获益。究其原因在于:一代CAＲ-T细胞无法有效归巢至肿瘤组织，不能持续存在于患者体内从而发挥功能［11］。MUC-16是另一卵巢癌肿瘤相关抗原，其编码的CA是临床用于卵巢癌诊断的较理想的标记物。纪念Sloan-Kettering癌症中心的BrentjensＲJ团队设计了靶向MUC-16的CAR-T细胞，基因编辑后的CAR-T细胞同时分泌IL-12并且表达人EGFＲt。IL-12可以增强CD8+T细胞的功能并改善抑制性的肿瘤微环境;人EGFＲt是西妥昔单抗的靶标，使用西妥昔单抗可诱导CAＲ-T细胞凋亡，有助于控制不良反应。在临床前研究中，将MUC-16特异性CAＲ-T细胞输注至移植了人卵巢癌细胞的免疫缺陷小鼠体内，CAR-T细胞能够持久存活并大量分泌IFNγ［12］。鉴于此，该癌症中心于年启动了基于MUC-16ecto靶点CAＲ-T治疗复发性卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌的Ⅰ期临床试验NCT［13］，其结果如何，我们拭目以待。此外，较具潜力的卵巢癌相关抗原靶点还包括间皮素(mesothelin)［14］、HEＲ-2［15］、L1-CAM［16］、CD等，这些抗原靶点结合新型的CAR-T技术在临床前研究中杀伤效果明显，I期临床试验也陆续启动，有望成为卵巢癌治疗的新策略。宫颈癌及内膜癌患者临床上常常能早诊早治，预后较好。CAR-T用于治疗复发难治患者，其靶点多为实体瘤中表达较普遍的抗原，目前进入临床试验阶段的主要是mesothelin特异性的CAR-T(NCT、NCT)。
2．2其他实体瘤第一代CAR-T治疗实体瘤虽然总体未见突出疗效，但是仍有一项临床试验的结果令人鼓舞。年，识别神经节苷脂2(diasialoganglioside，GD2)的CAＲ-T用于治疗儿童神经母细胞瘤效果明显:接受治疗的19例患者中，3例获得完全缓解，且CAR-T细胞可在患者体内持续存在［17］。二、三代CAＲ-T的治疗潜力仍在开发中。一项HEＲ-2特异性的二代CAＲ-T治疗HEＲ-2(+)复发转移肉瘤的临床研究显示出好的疗效:19例接受治疗的患者中，4例病情稳定，存活时长12周至14个月［18］。而另一项靶向HEＲ-2的三代CAＲ-T在治疗1例结肠癌患者时，因发生强烈的细胞因子风暴致使患者死亡［11］。可见二、三代CAＲ-T细胞活性高，应用需谨慎。目前世界范围内正在进行针对不同实体瘤抗原靶点的CAＲ-T细胞多中心临床研究，具有代表性的抗原靶点还包括:mesothelin(NCT、NCT、NCT)，用于治疗间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、肺癌;CEA(NCT、NCT)，用于治疗肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌;MUC-1(NCT、NCT)，用于治疗肝癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌;GPC3(NCT、NCT)，用于肝癌;EGFＲvII(NCT、NCT)，用于神经胶质瘤、头颈部肿瘤;PSMA(NCT)，用于前列腺癌等。
CAＲ-T抗肿瘤研究
（包括临床应用的瓶颈和对策）
虽然CAＲ-T有诸多优点，但其自身仍存在一些明显缺陷。随着未来临床试验的增加，必然会出现更多实际应用问题。
1，脱靶效应(on-target/off-tumortoxicity)
理想的目标抗原仅在肿瘤细胞表达。暂未能发现仅在肿瘤细胞表达的特异性抗原，任何会在正常细胞表达的抗原都有被误伤的风险。实体瘤常常同时表达多个肿瘤抗原，通过设计多个抗原复合的CAR结构，识别抗原组合，能够提高杀伤的特异性［19］，比如使用同时靶向抗原ErbB2和MUC1的CAR-T治疗乳腺癌［20］。肿瘤细胞的基因常常不稳定，一旦靶抗原丢失就会逃逸CAR的识别。间质细胞是肿瘤微环境的重要组分，直接影响肿瘤细胞，且基因表达稳定，故有研究选择基质细胞作为攻击对象，间接作用肿瘤细胞，以应对肿瘤细胞基因的不稳定突变［21］。第二军医医院的章浩等［22］发现，降低CAR-T细胞亲和力能提高杀伤特异性，减少“脱靶效应”，提高治疗的安全性,。
2，细胞因子风暴(cytokinereleasesyndrome)
在CAR-T抗肿瘤效应中，大量的细胞因子在其中发挥了重要作用，但也存在引发细胞因子风暴的隐患。细胞因子风暴是CAＲ-T细胞疗法常见且致死性的并发症。输注CAR-T细胞后，T细胞、B细胞、NK细胞以及单核/巨噬细胞释放大量的炎性细胞因子，包括IL-6、TNFα和IFNγ，这些炎性介质促发急性炎症反应诱导上皮及组织损伤，导致微血管渗漏，引起恶心、头痛、心动过速、呼吸急促等临床症状。细胞因子风暴的发生与CAＲ结构、肿瘤负荷及类型以及患者基因多态性相关，可通过设计安全的CAＲs并严格限制每次输注的细胞数量来降低发生风险。糖皮质激素及细胞因子拮抗剂具有减少细胞因子风暴相关死亡的作用。一些研究显示，高C反应蛋白(C-reactiveprotein，CＲP)与严重的细胞因子风暴相关，对其作为预测标记物的评估仍在进行中［3，23］。采用“自杀基因系统”特异性诱导CAＲ-T细胞凋亡，有助于降低细胞的毒性反应。有研究构建一种默认为关闭状态，只有在调控药物作用下才会开启的“On-Switch”CAＲ-T细胞，用以控制CAＲ-T作用的时间和剂量，提高治疗的安全性［24］。
3，神经毒性(neurologictoxicities)
少数急性淋巴细胞白血病患者在接受针对抗CD19的CAＲ-T细胞治疗过程中会出现谵妄、语言障碍、无动性缄默或癫痫等神经症状［13］。这些症状通常是自限性的，无需干预可自行缓解，且没有后遗症。神经毒性可能与患者脑脊液中出现CAＲ-T细胞相关，使用IL-6拮抗剂不能发挥预防作用。症状背后的发生机制未明，仍待探讨。
4，归巢(homing)
效应CAＲ-T细胞归巢至肿瘤组织是发挥其抗肿瘤功能的先决条件，也是实体瘤治疗中的研究难点。通过基因编辑使T细胞表达特定的趋化因子受体，可有助于T细胞归巢。研究发现，表达CCＲ4的T细胞能通过识别霍奇金淋巴瘤的标记物CD30定位到肿瘤组织［25］;表达CCＲ2b的T细胞能更好地靶向治疗神经母细胞瘤［26］。找出引导CAＲ-T靶向肿瘤的趋化因子，有助于实体瘤中CAＲ-T的定位。另有研究发现，小鼠胰腺癌肿瘤细胞周边的巨噬细胞能调控T细胞的浸润［27］。清除癌旁免疫抑制性的巨噬细胞，可能提高CAＲ-T细胞疗效。
5，持久性(persistence)
只有持续存活、具有增殖能力的CAＲ-T细胞才能有效清除病灶、预防复发。一代CAＲ-T治疗无效的主要原因之一是回输细胞不能持续存活。预先放/化疗能够清除抑制性Treg细胞，促进回输CAＲ-T细胞的存活和增殖［28］，但会增加感染的风险。直接补充或通过基因编辑使CAＲ-T细胞同时分泌细胞因子，也是提高其持久性的手段［12］。此外，通过多次细胞回输，构建特殊表型的T细胞(如干细胞样记忆性T细胞)或采用病毒共刺激的方法，也能增加CAＲ-T细胞的体内存活。
6，免疫抑制(immunosuppression)
实体瘤微环境中存在大量的免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞及细胞外基质分子、细胞因子，它们与肿瘤细胞一起，编织成巨大的免疫抑制网络。克服肿瘤环境中免疫抑制因子的干扰，也是CAＲ-T治疗有待解决的难题。目前，对CAＲ-T细胞再次进行基因编辑的常用策略有:CAＲ-T表达TGFβ受体的显性位点负向结构，用以拮抗TGFβ的抑制作用;靶向NKG2D来识别免疫抑制细胞MDSCs、Treg等表达的NKG2D配体;降低对Fas诱导凋亡的敏感性以及促进存活基因Bcl-X(L)的表达等。年，FDA已批准PD-1/PD-L1中和抗体用于部分实体瘤的治疗，联合使用免疫调节点中和抗体与CAＲ-T细胞，能抵抗肿瘤的免疫抑制，增强抗肿瘤免疫［29］。最近出现的TＲUCKs能够增加肿瘤微环境中IL-12的表达，下调免疫抑制细胞，进一步激活广泛的抗肿瘤免疫，发挥杀伤能力［30］。
结语
CAＲ-T在治疗血液肿瘤中的成功，为人类的抗癌战役带来了胜利的曙光。作为目前发展最迅速的生物疗法，全球的科研机构都对CAＲ-T倾注着巨大的研究热情。对Clinicaltrials上注册的临床试验进行统计发现，CAＲ-T研究主要分布在美国、我国和欧洲。为获得更卓有成效的CAＲ-T，还需进一步提高CAＲ-T靶点的特异性、促进CAＲ-T细胞向肿瘤组织迁移、筛选适合CAＲ-T发挥功效的肿瘤患者、控制细胞扩增和存在的时间。解决了这些问题，人类就有望在与肿瘤的博弈中取胜。
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